Du gène à la protéine sans cellule : une technologie prometteuse dans la recherche médicale

Publié le 03/02/2002

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Comme l'a rappelé le Pr Alexander Spirin (Russian Academy of Sciences), considéré comme le père spirituel du RTS, la synthèse de protéines in vitro, sans contraintes liées aux cellules vivantes, répond à un défi de passer en un temps record du gène à la protéine. D'ores et déjà, la production des protéines de 10 KDa à plus 120 KDa, d'origine procaryote ou eucaryote, entre dans une phase d'automatisation et d'industrialisation, bien qu'il reste encore quelques problèmes à résoudre.
Le système RTS fonctionne sur le principe d'échange en continu de petites molécules diffusibles au travers d'une membrane semi-perméable séparant la chambre réactionnelle du compartiment d'alimentation.

Le lysat d'Escherichia coli

Au gène d'intérêt sont ajoutées des séquences du promoteur T7 et de différents éléments de régulation soit par clonage dans un plasmide de type pIVEX, soit par amplification PCR. Ensuite, l'ADN matrice est transcrit en ARN messager à l'aide de l'ARN polymérase du phage T7 et de nombreuses copies d'ARNm sont immédiatement traduites en protéines grâce à un complexe ribosomique contenu dans le lysat d' Escherichia coli (machinerie de traduction et système régénérateur d'énergie). La protéine exprimée s'accumule pendant la durée de la réaction en quantité significative. Ainsi, le RTS 100 E. coli HY kit permet de cribler en quelques heures l'expression des protéines d'intérêt ainsi que d'optimiser les conditions d'expression de la protéine sélectionnée. Avec le RTS 500 E. coli HY kit, il est possible de produire en vingt-quatre heures jusqu'à 5 mg de protéine par réaction de 1 ml.
Dans le cadre de cette journée et en avant-première européenne, Roche Diagnostics a présenté le RTS ProteoMaster qui permet de produire jusqu'à 96 protéines en parallèle.
En ce qui concerne le marquage spécifique des protéines pour les études en cristallographie ou IRM, les résultats d'une évaluation réalisée par Jean-Michel Betton et coll. (Institut Pasteur) mettent en évidence que le marquage sélectif au niveau du 15 N/13 C atoms Asp et Arg (ces deux acides aminés sont représentatifs du métabolisme d' E. coli) de maltose-binding protéine est possible avec RTS 500 et de plus sans dilution isotopique.

De nouvelles classes d'antibiotiques

Dans le domaine des programmes de génomique structurale, la protéomique in vitro est d'un grand intérêt, étant donné que l'étape clé est la détection rapide et fiable de l'expression des protéines solubles qui seront purifiées. Les recherches de l'équipe de Vincent Monchois (CNRS, Marseille) qui portent sur les gènes conservés de fonction inconnue d' E. coli pourraient ainsi aboutir à la définition des nouvelles classes d'antibiotiques.
Parmi les expériences de production de protéines très utiles dans la recherche de traitements se rapportant à des pathologies humaines, citons à titre d'exemple la production d'une protéine toxique du parasite Babesia divergens, ou d'une séquence virale cytotoxique de la dengue (les protéines produites seront injectées à des animaux dans les protocoles d'immunisation). Autre application du RTS, celle portant sur l'expression de la protéine prion (PrP) murine dans un système acellulaire, qui offre la possibilité de modifier la composition du milieu réactionnel et donc d'atténuer les problèmes liés à la production de protéine sous forme de corps d'inclusions (alors que les protéines du PrP recombinante obtenues dans E. coli sont insolubles). Les premiers résultats de l'équipe de Jean Gagnon (CEA-CNRS-UJF, Grenoble) montrent que la PrP murine peut être préparée en quantité suffisante pour poursuivre l'analyse des mécanismes moléculaires qui sont impliqués dans la conversion de la protéine PrP normale en protéine anormale PrPsc, assurant ainsi la réplication de l'agent infectieux.

D'après les communications lors des premières rencontres RTS à l'Institut Pasteur de Paris, organisées par le groupe Roche Diagnostics.

Ludmila COUTURIER